l 該試劑盒用于體外定量檢測人 血清、血漿或其他相關(guān)生物液體中MT的濃度。

實驗原理：

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被有人褪黑素(MT)抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、HRP標記的抗原，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人褪黑素(MT)呈負相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成：

試劑盒參數(shù)：

需自備的設(shè)備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個標準品稀釋管.

樣本處理及要求：

1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低，請對樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。

2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。

3. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

6. 細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

7. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

8. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

9. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

檢測前準備工作：

1. 請提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 標準品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為500pg/mL)，然后按照以下濃度：500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、 15.6pg/mL、7.8pg/mL、0pg/mL進行稀釋。

倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,500pg/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成250pg/mL的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數(shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。

3. HRP-抗原工作液配制：使用前15分鐘將濃縮HRP-抗原于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP-抗原稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當(dāng)日使用。

4. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)

5. 晶溶解后再配置)。

操作步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照50μl每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入50μL通用稀釋液，緊接著每孔加入50μL HRP-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內(nèi)測試，從而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機洗板）。

4. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。

5. 加終止液：每孔加入終止液50μL，立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1. 計算標準品和樣本復(fù)孔的平均OD值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數(shù)坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值低于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線。

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

試劑盒性能：

1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平的人MT，計算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人MT，在標準曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。